蛋白质标记方法对于研究活细胞中的蛋白质很重要，基因组编辑工具使标记内源性蛋白质成为可能，以解决与过表达相关的问题。
2024年2月1日，北京大学刘涛团队在Nature Chemical Biology 在线发表题为“Tracking endogenous proteins based on RNA editing-mediated genetic code expansion”的研究论文，该研究建立了RNA编辑介导的非规范氨基酸(ncAAs)蛋白标记(RENAPT)，以特异性地标记活细胞中的ncAAs内源性蛋白。RENAPT以一种临时的、不可遗传的方式标记蛋白质，不受原间隔器邻近基序序列的限制。
使用荧光ncAA或具有生物正交反应手柄的ncAA进行随后的染料标记，证明了各种内源性蛋白质可以在其特定的亚细胞位置成像。此外，两种蛋白可以单独或同时使用两种不同的ncAA进行标记。此外，内源性离子通道和神经元特异性蛋白可以在初级神经元中实时标记。因此，RENAPT提供了一个有前景的平台，具有广泛的适用性，用于标记活细胞中的内源性蛋白，研究其定位和功能。
内源性蛋白的选择性标记和可视化是监测蛋白质动力学和研究活细胞内复杂相互作用以了解单个感兴趣蛋白(POI)细胞功能的重要工具。荧光技术极大地促进了对生命系统中蛋白质定位、结构和功能的研究。遗传融合已广泛用于POI的标记，包括但不限于荧光蛋白(FPs)、多种自标记酶和肽标签的融合，用于后续标记。然而，这些策略通常需要编码POI的开放阅读框(ORF)过表达，并且通常限于C端或N端和柔性环的蛋白融合，这可能会干扰POI的表达、折叠、定位和功能。相反，内源性蛋白的表达受到天然环境的严格控制，包括基因在染色质中的位置、原聚体和调节因子、mRNA的加工和剪接、翻译控制以及翻译后修饰。此外，FPs的尺寸限制了超分辨率显微镜的功率，并且它们在长时间激发后通常容易发生光漂白，这进一步限制了它们的应用。这些行之有效的方法虽然非常有用，但通常依赖于过度表达。抗体、小分子和多种化学探针为直接标记内源性蛋白提供了重要工具；然而，为特定的POI开发高度特异性的探针是非常具有挑战性的，而且这种探针通常无法用于大多数蛋白质。
此外，抗体不具有细胞渗透性，妨碍了它们在活细胞成像中的应用。基因组编辑方法的最新发展使得在编码POI的基因的ORF中原位敲入编码FP或特定标签的基因成为可能，提供了一种高度精确的内源性蛋白质标记方法，可以解决上述许多限制。然而，对于某些蛋白质，DNA水平上的突变可能是致命的或不可逆地改变细胞，导致可能导致错误结论的伪影。此外，许多蛋白质在编码POI的N端或C端用于标签敲入的基因序列附近的可编辑原间隔器邻近基序(PAM)位点通常是不可用的，这进一步限制了基于基因组DNA编辑的蛋白质标记的实用性。因此，开发一种真正灵活和普遍适用的内源性蛋白质标记方法是非常可取的。
RENAPT方法的示意图（图源自Nature Chemical Biology ）
遗传密码扩展(GCE)提供了一个最小的标签，通常用于活细胞成像。GCE通过引入正交氨基酰基-tRNA合成酶(RS)/tRNA对起作用，该对允许在无义密码子的作用下，将选定的残基的特定位点氨基酸替换为设计的非规范氨基酸(ncAA)。GCE允许对蛋白质结构和功能进行最小扰动的位点特异性蛋白质标记。由于氨基酸侧链的小尺寸，基于ncAA的最小标签已经发展成为最先进的工具，用于在活的哺乳动物细胞中标记蛋白质。然而，这些策略很大程度上依赖于含有无义密码子的ORF的瞬时过表达，这不适用于内源性蛋白质标记。
理想情况下，如果能在内源mRNA中引入无义密码子，则可以通过GCE实现原位蛋白标记。随着近年来RNA编辑工具的快速发展，在不改变原基因序列的情况下，将设计好的无义密码子直接引入编码POI的mRNA中，可以克服这些限制。这些可编程的RNA编辑工具已被用于各种需要临时的、不可遗传的编辑的应用。它们不受PAM位点的限制，只会以短暂和不可遗传的方式在mRNA的一部分中产生突变。目前，RNA碱基编辑器可以将腺苷(A)转化为肌苷(I)，在翻译过程中模仿鸟苷(G)，或将胞苷(C)转化为尿苷(U)，后者可用于引入无义密码子，用于随后的ncAA整合。
该研究建立了一种RNA编辑介导的ncAAs蛋白标记(RENAPT)方法，用于内源性POIs的位点特异性标记。该方法涉及RNA编辑，引入一个过早无义密码子，然后由一个正交tRNA识别，并与相应的正交tRNA合酶一起引入设计ncAA。内源性POI可以通过与ncAA侧链柄的生物正交反应直接用荧光ncAA或小荧光染料标记，用于活细胞成像。这个过程只需要一个简单的转染，结果可以在几天内观察到。RENAPT策略有望在不改变基因组DNA序列的情况下，为研究内源蛋白的功能和定位提供一种简单、方便和强大的工具。
北京大学药学院博士后郝敏为论文的第一作者，研究方向为合成生物学、碱基编辑和基因密码子扩展技术等，博士生凌鑫宇和讲师孙懿为论文共同第一作者。北京大学药学院刘涛研究员为论文通讯作者。该研究获得中国国家重点研发计划、国家自然科学基金、国家科技重大专项计划、中国博士后科学基金和北京市自然科学基金等项目的支持。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41589-023-01533-w
